Sydney, Vaughn, Jack e Dixon vengono reclutati da una sezione occulta della CIA che ha come capo nientemeno che Sloane. La prima missione è quella di recuperare un isotopo prima che questo finisca nella mani sbagliate. Nel frattempo, la riconciliazione fra Sydney e Vaughn è messa in dubbio, sebbene Lauren sia morta. Sydney ha scoperto un segreto del padre Jack che potrebbe minacciare la loro relazione.

Nonostante l'opposizione di Sydney, Sloane manda la ragazza e suo padre in missione per fermare una sorta di moderno samurai. Nadia è riluttante sul fatto di accettare o meno di tornare nei servizi segreti. Syd rivela a Vaughn di aver scoperto che Jack ha fatto uccidere Irina.

Per scoprire dove si trova un computer che è stato rubato, Syd deve convincere un trafficante ad interessarsi a lei. Vaughn è preoccupato del fatto che Weiss potrebbe essere stato ucciso durante una missione. In realtà, l'uomo è prigioniero insieme a Sydney. Quest'ultima e Jack discutono sul fatto di rivelare o meno a Nadia la terribile verità riguardante la morte della loro madre Irina.

Sydney va in missione sotto copertura come assistente medica, mentre Vaughn impersona un prete semi-ubriaco al fine di individuare e distruggere una nuova arma biologica. I demoni di Vaughn riguardanti la morte di Lauren vengono in superficie. Nadia si rivolge a Jack per avere informazioni sulla madre Irina.

Sydney e Vaughn debbono comportarsi come una vera e propria coppia sposata al fine di individuare un'arma ad impulso elettromagnetico, i cui effetti potrebbero avere delle conseguenze disastrose. I due sperimentano l'impatto del matrimonio sulla loro relazione e scoprono che il vicinato nel quale si sono infiltrati non è composto da persone del tutto innocue.

Dopo essere stata infettata da un allucinogeno, Sydney comincia a perdere contatto con la realtà. Vaughn e Jack lottano contro il tempo per trovare un antidoto prima che Syd metta in pericolo la propria vita e quella delle persone che le sono accanto.

Sydney e Nadia discutono a proposito di Sloane e del fatto che Syd non è ancora riuscita a dimenticare il passato. Quest'ultimo si preoccupa della salute della figlia, quando lei e Sydney vanno in missione sotto copertura. L'uomo vorrebbe sospendere un'operazione troppo pericolosa, ma Sydney e Nadia decidono di andare avanti per scoprire l'ubicazione di un laboratorio chimico.

La vita di Nadia è in pericolo. Sydney lotta per arrestare la sua nemesi Anna Espinosa. I demoni di Vaughn vengono in superficie quando l'uomo, per aiutare Sydney a salvare Nadia, incontra il suo mortale nemico: Sark. La squadra decide di far fuggire il criminale per scoprire l'ubicazione di un gruppo di terroristi che appartenevano alla Convenzione. Ma Sark ha riservato loro una sorpresa.

Sark accetta di aiutare Sydney e Vaughn a trovare Anna, ma solo se Vaughn accetterà di ottemperare ad una richiesta singolare inerente il corpo di Lauren. Jack pondera sui rischi che potrebbero derivare dal risvegliare Nadia dal coma indotto al fine di estrarre informazioni vitali riguardanti Anna. Sydney e Vaughn riescono a fermare Espinosa, ma Sark fugge dopo aver mantenuto la parola.

La teoria di Sydney secondo la quale Sloane sta cercando di riformare l'Alleanza minaccia la relazione della giovane con la sorellastra Nadia, la quale si rifiuta di credere che suo padre stia facendo il doppio gioco con la CIA. Vaughn è risoluto a scoprire alcuni segreti riguardanti suo padre, dopo che in un'agenda del genitore ha trovato alcune annotazioni successive alla sua morte.

Mentre è in missione in Germania, Sydney mette inavvertitamente in pericolo la vita di un civile americano. Jack organizza una mortale visita ad un vecchio amico. Vaughn scopre nuovi retroscena sulla vita di suo padre: avrebbe sparato alle spalle di un collega durante una missione.

Una missione va per il verso sbagliato e Sydney viene sepolta viva. Marshall è l'unico che può salvarla dal momento che il quartier generale dell'APO è stato esposto ad un mortale patogeno. Più tardi, Marshall e Sydney collaborano per sottrarre alcune informazioni dall'hard disk dell'uomo che ha ordinato la morte di Sydney.

Sydney e Vaughn rischiano la loro vita per scoprire la verità sul padre dell'uomo e su di un vecchio progetto denominato "Usignolo". Jack e Sloane cospirano insieme per impedire ai due agenti di scoprire la verità e per conoscere il luogo dove si trova la misteriosa Elena Derevko. Per salvare la vita di Sydney, Jack viene esposto ad una dose mortale di radiazioni.

Tramite zia Katya, Sydney scopre alcune verità scioccanti sul conto della madre. Vaughn si mette in una posizione pericolosa quando, con una squadra, collabora al furto di un manuale di Rambaldi per poter avere nuove informazioni riguardanti suo padre. Marshall si pone alcune domande circa la salute di Jack e, senza farglielo sapere, sottopone l'uomo ad alcune analisi.

Sydney è costretta ad allearsi con Sloane, allo scopo di individuare un uomo che nelle ultime settimane si è spacciato per Sloane e si è servito di Vaughn per i suoi loschi scopi. Nadia teme che ora che dovrà di nuovo occuparsi del mistero di Rambaldi, suo padre possa cadere vittima della sua antica ossessione.

Sydney e Nadia scoprono che Sophia, la donna che si è presa cura di Nadia quando era in orfanotrofio, è stata aggredita. Durante una missione insieme a Vaughn, Dixon deve affrontare un dilemma. A causa dell'esposizione alle radiazioni, Jack convince Sloane a rivelare le loro vere intenzioni a Sydney e Nadia. I due raccontano alle rispettive figlie dell'esistenza di Elena Derevko.

Sydney è scioccata quando viene a sapere che suo padre sta per morire. Ma soprattutto per il fatto che ha deciso di non dirglielo. Sophia continua la sua convalescenza nell'appartamento di Sydney, mentre organizza un piano per impossessarsi di un agente contaminante. Sydney deve impersonare la madre in una simulazione che dovrebbe convincere il padre a rivelare un'informazione.

Il misterioso uomo che ha impersonato Sloane ricompare: questa volta è alla ricerca di un fiore la cui essenza potrebbe essere mortale. Per scoprire il luogo in cui si trova il fiore, il vero Sloane decide di sottoporsi ad una regressione ipnotica che fa riaffiorare nuove scioccanti rivelazioni sul passato dell'uomo.

Dopo aver scoperto la verità su Sophia, l'unità si mette sulle sue tracce. Sloane sembra essere caduto di nuovo preda della sua ossessione per Rambaldi. Per questo motivo spara a Dixon. Jack si incontra con Katya, mentre Vaughn chiede a Jack la mano di Sydney. Elena riesce a trafugare tutti i manufatti di Rambaldi in mano alla CIA e progetta di costruire l'arma finale.

Dopo avere scoperto che Irina Derevko è ancora viva, Jack, Sydney e Nadia provano a rintracciarla allo scopo di mettere fine al piano mortale ordito da Elena mediante l'arma di Rambaldi. Un'intera città, in Unione Sovietica, cade preda della follia che ora potrebbe estendersi a tutto il mondo. Una squadra APO si reca sul posto per mettere fine al diabolico piano.

Sydney, Jack, Irina, Vaughn e Nadia sono gli unici che possono salvare il mondo dal piano ordito da Elena Derevko. La profezia di Rambaldi inerente Sydney e Nadia è ad un passo dal divenire realtà. Elena avvelena Nadia e la costringe a battersi contro Sydney, così Sloane è costretto a sparare alla figlia. Syd può così disattivare l'arma di Rambaldi e mettere fine al progetto di Elena. Sulla strada per Santa Barbara, Vaughn ha in serbo una rivelazione per Sydney ma i due vengono coinvolti in un incidente stradale.