Sydney Bristow is overdag student en 's avonds een internationale spion. Haar leven ziet er rooskleurig uit nadat haar vriend, Dr. Daniel Hecht, haar ten huwelijk heeft gevraagd. Maar de blijdschap om haar verloving is van korte duur wanneer haar dubbelleven enorme gevolgen heeft voor hun relatie. Tegelijkertijd ontdekt ze nieuwe feiten over de vage mensen voor wie ze werkt. Een leven met nog meer gevaar en intriges.

In haar nieuwe rol als dubbelspion voor de CIA is Sydney - die nog steeds rouwt om de recente dood van haar verloofde Danny - vastbesloten om SD-6 binnen een paar weken uit de weg geruimd te hebben. Ze ontdekt al snel dat SD-6 veel groter en veel machtiger is dan ze zich had kunnen voorstellen. Will ontdekt de eerste raadselachtige aanwijzing van de moord op de verloofde van Sydney.

Sloane stuurt Sydney en Dixon naar Madrid om een kluisje te stelen. In het kluisje zit een schets van vermoedelijk een cijfercode, opgetekend door de filosoof Milo Rambaldi aan het eind van de 15e eeuw. Nadat ze een spoor van artefacten van Rambaldi heeft gevolgd, staat Sydney oog in oog met haar aartsvijand, Espinosa. Intussen begint Will tijdens het onderzoek naar de dood van Daniel Hecht te vermoeden dat hij verzeild is geraakt in iets wat groter is dan alleen een toevallige moord.

Sydney en Anna leren de binaire code van Milo Rambaldi uit hun hoofd. Sydney en Dixon krijgen als missie een complot te onderzoeken van terrorristen om de United Commerce Organization uit de weg te ruimen. Francie vermoedt dat haar vriend vreemdgaat, terwijl Will verdergaat met het ontrafelen van het mysterie rond de moord op de verloofde van Sydney.

Will zegt tegen Francie dat hij de dood van Danny onderzoekt. Sydney's leven loopt gevaar wanneer Agent Sloane vermoedt dat een man die door SD-6 wordt vastgehouden, een bedrieger is. Geheimen uit het verleden worden verder ontrafeld voor Will en Sydney wanneer Will meer aanwijzingen ontdekt over de moord op Daniel Hecht, en Sydney nieuwe informatie over het verleden van haar vader krijgt.

Sydney begint te vermoeden dat Jacks verdachte activiteiten hebben geleid tot de dood van haar moeder, 20 jaar geleden, waardoor de spanning tussen hen alleen maar groter wordt. Intussen gaat Sydney door met haar werk als dubbelspion, met levensgevaarlijke missies in Londen en Boekarest voor SD-6.

Sydney zit vast in een inrichting nu haar partner dood is en haar leven in gevaar is. Ze werkt aan een ontsnapping, maar intussen leert ze meer over de rol van Shepard in haar verleden. Sloane confronteert de Alliance met het computervirus van de CIA. Ze komen tot de conclusie dat er een mol zit binnen SD-6.

Sydney reist af naar Oxford om een antieke, mysterieuze klok te stelen die verband houdt met de oude profeet Milo Rambaldi. Deze ogenschijnlijk eenvoudige missie blijkt veel complexer en gevaarlijker te zijn dan Sydney had verwacht. Intussen krijgt Sloane steeds meer vermoedes dat Sydney en/of haar vader Jack mollen zijn. Daarom worden de vaardigheden van Sydney als dubbelspion danig op de proef gesteld.

Sydney is bang. Ze denkt dat haar status als mol is verraden nadat ze haar connecties bij de CIA heeft gebruikt om het leven van Dixon te redden. Agent Sloane krijgt steeds meer argwaan. Intussen vindt Will meer dan hij had gedacht in de auto van Eloise Kurtz - een mysterieuze microfoon die is ingeschakeld. Wie luistert er mee aan de andere kant?

Jack moet Sydney redden. Sloane verdenkt haar ervan de mol binnen SD-6 te zijn en wil dat ze wordt gemarteld en gedood. Zo brengt Jack z'n eigen leven in gevaar. Ondertussen vertelt Sydney Vaughn over haar tijd bij SD-6. Als Will luistert naar een geluidsopname van de moord op Eloise Kurtz, hoort hij het woord SD-6 voor de eerste keer.

Nadat Sydney's vader tijdens een missie in Havana haar leven redt, is ze onder de indruk van zijn kunde als geheim agent. Maar als ze van Vaughn hoort dat Jack ooit in opdracht vele CIA-agenten heeft vermoord, krijgt ze gemengde gevoelens. Sydney gebruikt de nieuwste snufjes en haar natuurlijke charme tijdens een missie in het Griekse Athene.

Nadat Sydney te weten is gekomen dat haar moeder als KGB-agent verantwoordelijk is geweest voor de dood van veel CIA-agenten, wordt Sydney gekweld door verdriet en het gevoel dat ze is verraden. Ze vertelt Vaughn dat ze geen spion meer wil zijn, maar weigert om onder te duiken en deel te nemen aan een speciaal CIA-beschermingsprogramma. Een groep zwaarbewapende mannen weet het SD-6 gebouw binnen te dringen en te bezetten. Regisseur/producent/schrijver en acteur Quentin Tarantino heeft een gastrol als leider van deze schurkengroep.

Sydney vindt een briefje van haar vader waarin hij de netelige situatie uitlegt: als de kluis van SD-6 wordt geopend, zal er een dodelijke explosie plaatsvinden. Nu hij het bij SD-6 voor het zeggen heeft, gaat schurkenleider McKenas op zoek naar Sloane en speurt hij naar een mysterieus apparaat. Een risicovolle confrontatie vol dreiging en zelfopoffering is het gevolg.

Sydney en Dixon reizen naar Las Vegas om de groep op te sporen die SD-6 bijna heeft vernietigd. Sydney ontdekt dat op precies dezelfde dag dat SD-6 door een anonieme organisatie werd aangevallen, concurrent FTL ook is belaagd, waarbij hun leider is omgebracht. De verantwoordelijke voor de aanval op FTL, die door Cole 'De Man' werd genoemd, bezit nu de grootste verzameling Rambaldi-artefacten ter wereld. Sloane stuurt Sydney en Dixon naar Moskou. Ze moeten 'De Man' in de gaten houden en een beeld van hem krijgen.

SD-6 is te weten gekomen dat K-Directorate het Rambaldi-manuscript - dat ze bij een eerdere missie van Sydney stalen - zal overdragen aan de nieuwe spionageorganisatie die door 'De Man' wordt geleid. Sydney en Dixon worden naar Tunesië gestuurd om het boek terug te krijgen en naar SD-6 te brengen. Het boek belandt echter in een kluis in het huis van Sloane. Vaughn draagt Sydney op om Sloane's privékluis open te breken.

Het Bureau voor Wetenschappelijke Analyse, een geheim eenheid van de NSA die paranormale activiteit onderzoekt, beschikt over een Rambaldi-manuscript met een 500 jaar oude afbeelding van een vrouw die sprekend op Sydney lijkt. Sydney moet verklaren hoe het mogelijk is dat dit oude object verband met haar houdt. Met een gastrol van Roger Moore als Edward Poole, lid van de Alliantie van Twaalf.

De afdeling Speciaal Onderzoek, een geheime dienst van de NSA, heeft Sydney in hechtenis genomen, omdat ze menen dat zij de nationale veiligheid in gevaar brengt. Uit onderzoek blijkt dat ze als twee druppels water lijkt op de vrouw uit een 500 jaar oude profetie van Rambaldi. Een vrouw die 'grote macht in totale vernietiging zal omzetten'. FBI-agent Kendall ondervraagt Sydney in het bijzijn van een team van verhoorders. Terwijl ze wordt ondervraagd naar haar mogelijke banden met het Rambaldi-artefact, doet Sydney een schokkende ontdekking die het mysterie van de 500 jaar oude profetie zou kunnen verklaren.

Om te bewijzen dat ze niet de vrouw uit de profetie van Rambaldi is die de wereld zal vernietigen, beklimt Sydney de Monte Subasio. Volgens Rambaldi's profetie zal ze die klim niet volbrengen. Bij terugkomst komt Sydney tot haar verrassing haar ex Noah tegen, een SD-6-agent met wie ze vijf jaar eerder iets had. Hij moet de bezigheden van 'De Man' in de gaten houden.

Sydney en Vaughn gaan Mr Sark ontmoeten en willen zo proberen om Khasinau te pakken te krijgen. Als iemand van SD-6 dat wil voorkomen, loopt Sydney bijna tegen de lamp. Will komt achter de identiteit van een van zijn ontvoerders, en Emily Sloane's toch al kwetsbare leven loopt verder gevaar door haar onthulling aan Sydney.

Sydney en Dixon moeten naar een Parijse nachtclub waar Sark de ampul aan Khasinau zal geven. Dixon moet pagina's uit een Rambaldi-manuscript stelen. Wills wereld stort in als zijn onderzoek naar SD-6 hem steeds verder voert. Dixon stelt vragen bij Sydney's bezigheden.

In Los Angeles krijgt Sydney een akelig telefoontje van Sark. Hij vertelt haar dat Will in Taipei wordt gegijzeld en pas wordt vrijgelaten als Sydney hen het document en de ampul van Rambaldi overhandigt. Jack sluit een deal met Mr Sark en de Alliante bezegelt het lot van Emily Sloane. Sydney komt oog in oog met 'De Man' te staan.