Seit Jahren arbeitet Sydney Bristow als Agentin für die „SD-6“, einer Spezial-Einheit der CIA. Jetzt will sie ihrem Verlobten Danny von diesem Doppelleben erzählen, aber sie weiß auch, dass sie damit ein Sicherheitsrisiko eingeht. Prompt wird Danny ermordet, und auch Sidneys Leben ist plötzlich in Gefahr. Da entdeckt sie, dass die Spezialeinheit nie der CIA angehört hat. – Auftakt zur actiongeladenen Agentenserie mit Golden-Globe-Gewinnerin Jennifer Garner.

Nach ihrer Entdeckung arbeitet Sydney nun als Doppelagentin. Sie nimmt Kontakt zu dem zuständigen CIA-Agenten Michael auf und erzählt ihm von ihrer SD-6-Mission. Sie ist fest entschlossen, mit Hilfe der CIA die alte Spezialeinheit zu zerschlagen. Doch Vaughn beweist ihr, dass SD-6 weitaus mehr Einfluss hat, als sie denkt. Unterdessen recherchiert Sidneys Freund Will weiter im Mordfall ihres Verlobten Danny.

Sydney und Dixon sollen in Madrid eine Kiste mit einem digitalen Code klauen. Diesen Code hat vor 500 Jahren der Wissenschaftler Milo Rambaldi erschaffen. Obwohl die russische Agentin Anna ebenfalls hinter dem wertvollen Gut her ist, gelingt es den zwei SD-6 Agenten, den kleinen Kasten in die LA-Zentrale zu bringen. Sie können ihn jedoch nicht öffnen, denn ein eingebauter Mechanismus würde den Code zerstören.

In einer Kirche in Malaga kommt es zu einem erbitterten Kampf zwischen Sidney und der russischen Agentin Anna, den Sidney gewinnt. Dadurch gelangt sie in den Besitz einer goldenen Kristallscheibe, einem weiteren fehlenden Puzzlestück im Rambaldi-Geheimnis. Anschließend wird sie mit Dixon nach Casablanca geschickt, um dort einen Terrorakt zu verhindern.

Ein neuer Auftrag für Sydney und ihren Kollegen Dixon. Sie sollen den Deutschen Jürgen Schiller sicher in die USA bringen. Als Gegenleistung will er der SD-6 Auskünfte über einen Impfstoff gegen biologische Waffen geben. Doch die CIA tauscht unbemerkt Schiller gegen Paul, einen ihrer Agenten, aus. Ein verhängnisvoller Fehler, denn dadurch droht Sydneys Tarnung aufzufliegen.

Sydney findet heraus, dass ihr Vater scheinbar etwas mit dem Tod ihrer Mutter zu tun hatte. Doch vorläufig kann sie sich nicht weiter um die Sache kümmern, denn die Arbeit fordert ihre ganze Aufmerksamkeit. In London soll sie zusammen mit Dixon einen bestimmten Decoder entwenden. Doch das entsprechende Gerät funktioniert nur mit dem DNA-Code des Benutzers, und der wurde ermordet.

Sydney ist in einer Nervenklinik in Bukarest eingesperrt. Ihr Partner Fisher ist tot, und Kreshnik, Leiter der Anstalt, ist Agent des K-Direktorats und hat Sydney durchschaut: Nun will er von ihr Informationen über Parkashoffs Leiche, die sie aus dem Patienten Shepard herauspressen soll. Doch dafür muss Sydney Shepard davon überzeugen, dass sie nicht zu den Leuten gehört, die ihn zu einem Mörder programmiert haben. Als ihr Shepard schließlich vertraut, gelingt ihnen die Flucht.

Sydney ist es gelungen, in Oxford eine alte Uhr von Rimbaldi zu stehlen, hinter der auch die russische Agentin Anna her ist. Sie bringt die Uhr nach Italien zu Giovanni Donato, dem Nachkommen ihres Erbauers, um sie reparieren zu lassen. Als nun Marshall entdeckt, dass die Glasscheibe aus dem Kirchenfenster in Malaga in die Uhr passt und bei einer bestimmten Zeigerstellung eine Sternenkarte zeigt, reisen Dixon und Sydney nach Südamerika, um dem Rätsel auf die Spur zu kommen.

Auf der Suche nach dem wertvollen Buch von Rimbaldi wird Dixon in Südamerika schwer verletzt. Der russischen Agentin Anna aber gelingt es, mit dem Buch zu entkommen. Währenddessen vermutet SD-6-Agent Dryer in Sydney den gesuchten Maulwurf. Sloane glaubt das nicht, will aber lieber sichergehen: Er schickt Sydney in die Toskana und sendet an SD-4 den Befehl zu ihrer Liquidierung – und zwar so, dass die CIA ihn abfangen kann. Doch Jack durchschaut Sloanes geschickte Falle.

Sydney erwacht in einer Gefängniszelle und soll ihren angeblichen Verrat am SD-6 gestehen. Um sie auszuhorchen, wird Russek mit in ihre Zelle gesperrt, doch Sydney schweigt beharrlich. Dann stellt sich heraus, dass nicht Sydney die undichte Stelle ist, sondern Russek … Sydneys nächster Auftrag führt sie nach Semba Island, wo sie den untergetauchten Hassan suchen soll. Doch dieser befindet sich in Kuba, und dort versucht Jack, ihn aufzuspüren …

Auf Kuba wird Jack von Hassan gezwungen, Sydney zu erschießen. Während Jack die Waffe auf Sydney richtet, sendet er ihr Morse-Signale zu, und die beiden können Hassans Wachen überwältigen. Dabei wird Hassan von Jacks Kugeln getroffen, und als Beweis fotografiert Jack den toten Hassan. Sloane ist zufrieden, weiß er doch nicht, dass Hassan nicht tot ist, sondern noch lebt! Er befindet sich im Gewahrsam der CIA.

Die Wahrheit über ihre Mutter wirft Sydney total aus der Bahn: Sie war eine KGB-Agentin! Sydney entschließt sich, ihren Dienst beim SD-6 zu quittieren. Nachdem sie Vaughn ihre Entscheidung mitgeteilt hat, kann sie das SD-6-Gebäude nicht mehr verlassen: Eine Gruppe schwer bewaffneter Terroristen hat die Gewalt über den Gebäudekomplex übernommen, und Sydney kann sich mit Jack in den Keller retten. In ihrem Versteck macht Jack seiner Tochter klar, dass sie nicht aussteigen könne …

Der ehemalige SD-6-Agent McKenas Cole arbeitet jetzt für die andere Seite und will sich an Sloane rächen. Deshalb hat er die Zentrale eingenommen und will den dortigen Tresor knacken. Doch beim Öffnen des Safes droht das gesamte Gebäude in die Luft zu fliegen. Dixon schickt einen Hilferuf an die CIA ab. Doch dort wurde Vaughn durch einen anderen Verbindungsmann ersetzt. Und der ist mit der Situation völlig überfordert. – Gaststar Quentin Tarantino als Terrorist.

Sydney erfährt nach dem Überfall auf SD-6, dass der Anschlag von dem mysteriösen „The Man“ in Auftrag gegeben wurde. Kurz zuvor hatte „The Man“ für die Zerschlagung von FTL, einer rivalisierenden Organisation von SD-6, gesorgt. Nun vermutet Sloane, dass sich ein Mittelsmann von „The Man“ mit dem K-Direktorat in Verbindung setzen wird, um die erbeuteten Rambaldi-Technologien anzubieten. Sydney reist nach Las Vegas, wo sie dem Mittelsmann eine Wanze unterschieben soll …

Sydney und Dixon erhalten den Auftrag, ein Manuskript von Rambaldi zu stehlen, das sich im Besitz des K-Direktorats befindet. Nachdem man herausgefunden hat, dass die Unterlagen auf einem Boot vor der tunesischen Küste sind, reisen Sydney und Dixon dorthin, um den Raub vorzunehmen. Alles läuft glatt, doch eines können sich weder Sloane noch Vaughn erklären: Die Seite 47 ist leer! Vaughn beauftragt nun Sydney, diese Seite gegen eine Kopie auszutauschen und ihm zu übergeben …

Sydney wird vom DSR, einer Sondereinheit des FBI, verhört. Der Grund: Ein Foto von Sydney und ein dekodierter Text auf Seite 47 des Rambaldi-Manuskripts, die „Prophezeiung“, belasten Sydney. Unterdessen hat SD-6 herausgefunden, dass hinter „The Man“ Alexander Khasinau steckt, ein ehemaliger KGB-Agent. Sloane will ihn beseitigen lassen und kontaktiert dazu Edward Poole, den Leiter von SD-9. Was er aber noch nicht ahnen kann: Khasinau und Poole stecken unter einer Decke …

Sydney wird weiterhin von dem FBI-Agenten Kendall verhört. Er ist überzeugt davon, dass Sydney jene Person ist, die Rambaldi in seinen Prophezeiungen genannt hat. Laut Rambaldis Aussage handelt es sich um einen Menschen, der „die größte Macht in völlige Verwüstung stürzen wird“. Sydney hat nun keine andere Wahl mehr, als Kendall über ihren Werdegang bei SD-6 und ihre Tätigkeit als Doppelagentin für die CIA zu berichten …

Sydney konnte vor dem FBI fliehen und hat nur noch ein Ziel: Beweise für das Überleben ihrer Mutter Laura zu finden. Sie ist nicht die Einzige, auch die CIA sucht inzwischen nach ihr. Anstatt Sydney auf ihren eigenen Wunsch zu beurlauben, schickt Sloane sie mit Dixon nach Wien. Dort sollen sie sich auf einem Maskenball mit jemandem treffen, der ihnen mehr über Khasinau sagen kann.

Sydney und Vaughn wollen Khasinau eine Falle stellen: mit Hilfe einer gefälschten zweiten Flasche der Rambaldi-Flüssigkeit. Ihr Plan scheint tatsächlich zu funktionieren. Doch dann entdeckt Vaughn, dass Sloane über das zweite Fläschchen Bescheid weiß.

In Denpasar wird Sydney während ihrer Flucht verletzt. Agent Vaughn kann zwar gerade noch Schlimmeres verhinder, doch dabei verlieren sie Sark an SD-6. Der erhält von Sloane ein verlockendes Angebot: Wenn er sie zu Khasinau führt, erhält er seine Freiheit zurück.

Um Will freizulassen, verlangt Sark von Sydney die Rambaldi-Seite über den Kreisumfang samt der Flüssigkeit, ohne die die Seite wertlos ist. Sydney steckt nun in einer Zwickmühle, denn sie kann die CIA nicht um Hilfe bitten. Gemeinsam mit Jack plant sie Wills Austausch, ohne ihm jedoch die ganze Wahrheit mitzuteilen.