Drei Jahre sind seit der Gift-Attacke auf Präsident Palmer vergangen. Jack Bauer arbeitet wieder für die CTU, und auch seine Tochter Kim ist dort inzwischen als Computer-Spezialistin tätig. Chef der Abteilung ist Tony Almeida. Sie alle werden vor eine neue große Herausforderung gestellt, als Terroristen, die im Besitz eines tödlichen Virus sind, die Freilassung des Drogenbarons Ramon Salazar fordern. Sollte sich die Regierung weigern, drohen die Terroristen damit, das Virus in Los Angeles freizusetzen, von wo aus sich die Seuche in Windeseile über alle Erdteile ausbreiten würde...

Zwischen Jack und seinem neuen Partner Chase kommt es zu Problemen, nachdem Jack erfahren hat, dass seine Tochter seit einer Weile mit Chase liiert ist. Zudem macht Jack seine offensichtliche Drogenabhängigkeit zu schaffen. Trotzdem finden er und Chase eine Spur, die zu Kyle Singer und dem Ort führt, wo das Virus aufbewahrt wird. Präsident David Palmer ist wieder in L.A., um seine Wiederwahl vorzubereiten. Sein Bruder Wayne ist sein neuer Stabschef und fürchtet, dass Davids neue Freundin Anne seine Chancen auf die Wiederwahl verschlechtern würde.

Jack und Hector Salazar suchen beide fieberhaft nach Kyle Singer, während Chase feststellen muss, dass er von Jack kaltgestellt wurde. Doch als Jack mit einem Team ins Haus der Singers eindringt, versucht Kyles Mutter die Drogen im Badezimmer verschwinden zu lassen. Jack kann nicht mehr verhindern, dass das Virus dadurch in die Kanalisation gelangt. Präsident Palmer streitet indessen noch immer mit seinem Bruder darüber, wie schädlich Annes kriminelle Vergangenheit für Palmers politische Zukunft ist. Schließlich versucht ein Team unter Tonys Leitung, Kyle zu fassen. Doch Salazars Männer sind ihnen zuvorgekommen...

Michelle ist von persönlichen und beruflichen Verpflichtungen zerrissen, als sie die CTU übernehmen muss, nachdem Tony verwundet wurde. Kyle und Linda werden von Hectors Männern gefangen genommen. Jack und Palmer führen ein geheimes Gespräch und veranlassen Jack, angesichts der Bedrohung durch die Salazars drastische Maßnahmen zu ergreifen. Aber Jacks Pläne sind kompliziert, als Chase in die Quere kommt. Anne führt Palmer, angesichts des Erpressungsplans ihres Ex-Mannes, auf den Boden der Tatsachen zurück.

Jacks Versuch, Ramon zur Flucht aus dem Gefängnis zu verhelfen, löst eine Gefängnisrevolte aus. Sie werden beide von den Gefangenen als Geiseln genommen. Chase erhält die Befehlsgewalt und versucht Jack und Ramon zu befreien. Während Kim versucht, Kyle ausfindig zu machen, sucht der verzweifelt nach einem Weg, wenigstens Linda zu retten. Als Chloe in Michelles Auftrag Jacks Büro durchsucht, um eine Erklärung für Jacks Verhalten zu finden, entdeckt sie, dass er ein Drogenproblem hat. Sie informiert auch Kim und Michelle darüber. Gleichzeitig beginnt die Präsidentschaftsdebatte zwischen Palmer und Keeler.

Jack und Ramon sind weiter auf der Flucht, während Palmer die Präsidentschaftsdebatte wegen des Vorfalls unterbricht und Chapelle das Kommando bei der CTU übernimmt. Chapelle fragt den Präsidenten, ob er Jacks Hubschrauber abschießen lassen soll, aber bevor er eine Antwort erhält, erreichen Jack und Ramon das Stadtgebiet, was einen Abschuss zu riskant macht. Kyles Eltern erfahren, dass ihr Sohn nur noch wenige Stunden zu leben hat, und Kim findet heraus, dass Gael die ganze Zeit mit Salazar in Kontakt stand. Trotzdem kann sie nicht mehr verhindern, dass ihr Vater in die Gewalt der Salazars gerät.

Chapelle informiert die CTU darüber, dass Kyle Singer nicht mit dem Virus infiziert ist und dass man daher nun unbedingt Jack und Salazar finden müsse, die noch immer auf der Flucht sind. Indessen stellt sich heraus, dass Gael die ganze Zeit über mit den Salazars in Kontakt stand. Während er verhört wird, besucht Michelle Tony im Krankenhaus. Aber als sie ihm von Gael erzählt, besteht er darauf, sofort zur CTU zurückzukehren. Chase erfährt, dass sich Hector Salazar in Nord-Mexiko aufhalten soll und sucht dort einen Kontaktmann auf. Anne macht sich auf den Weg zu ihrem Ex-Mann, der ihr entlastende Papiere übergeben will. Indessen versucht Jack seinen Bewacher im Flugzeug zu überwältigen.

Tony informiert Palmer darüber, dass die Drohung der Salazars, das Virus freizusetzen, von Tony, Jack und Gael inszeniert wurde, um Jack bei den Salazars einzuschleusen. Jack hatte erfahren, dass ukrainische Wissenschaftler das Virus auf dem freien Markt anbieten. Daher brachte er die Salazars als potentielle Käufer ins Spiel, damit die CTU bei der Übergabe das Virus sicherstellen könnte. Um den Präsidenten zu schützen, habe man ihn nicht eingeweiht. Palmer ist verärgert, hat aber keine Wahl, als Jack weitermachen zu lassen. Als Tony erfährt, dass Chase auf eigene Faust nach Jack sucht, fürchtet er, dass Chase damit den ganzen Plan zum Scheitern bringt.

Die Übergabe des Virus steht kurz bevor und die CTU hat keine Ahnung, wo sich Jack befindet. Währenddessen versucht Tony mit einigen Ausfallerscheinungen zu kämpfen. Beim Präsidenten gibt es erneut Probleme, die ihn an der eigentlichen Arbeit hindern.

Claudia gelingt es, Chase aus seinen Fängen zu befreien, doch sie bezahlt einen hohen Preis für ihre Bemühungen. Wayne wendet sich an Julia, während Palmer Sherry um Hilfe gegen Milliken bittet. Jack und Ramon schmieden Pläne, um zu Nina zu gelangen, in der Hoffnung, den Virus abzufangen. Chloes Arbeit in der CTU wird unterbrochen, als sie gezwungen ist, sich um ihr Baby zu kümmern.

Jack befindet sich weiterhin in der Gewalt von Nina – lässt aber natürlich nichts unversucht, dieser zu entfliehen. Derweil kommt es wiederholt zu mehr oder weniger schweren Streits zwischen den Salazars. Palmer beauftragt derweil seine Ex-Frau Sherry, sich der Milliken-Angelegenheit anzunehmen.

Die Übergabe in Mexiko steht kurz bevor. Nachdem Hector erschossen wurde, leitet Ramon Salazar nun die Geschäfte und schickt Nina zu Amador, um die Übergabe durchzuführen. In L.A. gräbt Sherry derweil eine von Millikens Leichen aus.

Jack, Chase und Nina fliegen zurück zur CTU. Nina hat jedoch bereits einen Plan geschmiedet, um wieder aus der Staatsgewalt zu entkommen. Währenddessen versucht Sherry an Millikens Handy heranzukommen, um herauszufinden, wen er in der letzten Zeit angerufen hat.

Nina wird in der CTU verhört und Jack wegen seiner Drogensucht befragt. Sherry tischt Palmer derweil eine Lüge nach der anderen in Bezug auf den Tod von Milliken auf.

Chappelle hat Zweifel, ob Jack Nina nur aus Notwehr getötet hat. Währenddessen bereiten sich Amador und Alvers darauf vor, den Virus in der Öffentlichkeit freizusetzen. Sherry bekommt in Sachen Milliken langsam einige Probleme, dass ihre Lügen auffliegen.

Im Hotel werden die ersten Gäste infiziert – die Inkubationszeit ist scheinbar doch deutlich kürzer als 14 Stunden. Derweil verfolgt Jack Amador, und Palmer ist sich unschlüssig, was er der Polizei erzählen soll.

Michelle muss mit ansehen, wie Gael immer stärkere Schmerzen hat. Derweil wird der Präsident von Stephen Saunders erpresst und Jack findet heraus, wer der Terrorist ist.

Palmer kann der Forderung von Saunders auf keinen Fall zustimmen, doch Jack meint, die Alternative wäre noch katastrophaler. Derweil verschwindet unbemerkt einer der Hotelgäste – möglicherweise infiziert er gerade die ganze Stadt.

Die CTU findet heraus, dass Saunders eine Tochter hat. Für das Doubeln findet sich jedoch nur eine Person, was Jack ganz und gar nicht gefällt… Der Präsident entschließt sich derweil, das Kabinett zu informieren, was in den letzten Stunden geschehen ist. Auch die Leute dort sind alles andere als begeistert, diese Dinge zu hören.

Die CTU kann herausfinden, wo sich Saunders aufhält und macht sich auf den Weg. Derweil beruft Palmer eine erneute Pressekonferenz ein und Michelle bekommt ihr Testergebnis.

Tony wird nach wie vor von Saunders erpresst. Dieser will nun seine Tochter frei sehen. Anderswo versucht Sherry nun mit einer neuen Methode, ins Weiße Haus zu kommen

Als David Palmer von Senator Keeler mit Sherrys Vorwürfen konfrontiert wird, schickt er seinen Bruder los, um Sherrys Beweismittel zu stehlen, Jack überwältigt Tony und zwingt ihn, bei einem fingierten Austausch von Michelle und Jane Saunders mitzumachen. Doch die Übergabe läuft nicht gerade glatt.

Saunders ist endlich bereit zu kooperieren, doch weiterhin bleibt einer der Virus-Sprengsätze verschwunden. Derweil bricht Wayne in das Haus von Sherry ein, um nach den Beweisen zu suchen.