Naar aanleiding van de gebeurtenissen uit The Avengers krijgt Phil Coulson, die nog in leven blijkt te zijn, opdracht een team samen te stellen. De eerste opdracht van dit team is Mike Peterson, een man met superkrachten, te onderzoeken. Skye, een vrouw die lid is van De Rising Tide, waarschuwt Peterson voor het S.H.I.E.L.D.-team, maar hij weigert haar hulp. Het blijkt dat Peterson zijn krachten krijgt van een serum horende bij het Project Centipede, dat hij gekregen heeft van een onbekende organisatie. Peterson, nu een voortvluchtige, neemt Skye gevangen.

De volgende missie van Coulsons team is in Peru, waar ze een voorwerp dat enkel bekend staat als een “0-8-4” moeten opsporen. Het blijkt te gaan om een oud HYDRA-wapen. Coulson ontmoet zijn oude collega Camilla Reyes en brengt haar team ook aan boord van zijn vliegtuig. Ze verraadt Coulson echter en smeedt plannen het wapen voor zichzelf te stelen om er een groep rebellen mee te vermoorden. Coulson krijgt van Nick Fury te horen dat Skye gevaarlijk is.

Dr. Franklin Hall, een medewerker van S.H.I.E.L.D., wordt ontvoerd door zijn voormalige zakenpartner Ian Quinn. Hij wil dat Hall voor hem een generator bouwt die middels een substantie genaamd "gravitonium" de controle over de zwaartekracht kan krijgen. Skye biedt zich aan als vrijwilliger om te infiltreren in Quinn’s landhuis op Malta, zodat Coulson en Ward Hall kunnen redden. Hall werkt ondertussen in het geheim aan zijn eigen plannen. Hij wil de generator vernietigen, ondanks dat hij hiermee miljoenen levens zal riskeren.

Coulson en zijn team onderzoeken een reeks diamantdiefstallen. De dief blijkt een oude bekende van hen te zijn, Akela Amador. Ze wordt echter tot haar daden gedwongen door een opdrachtgever die een kunstmatig, met explosieven geladen oog bij haar heeft aangebracht, wat hij elk moment kan doen exploderen. Het team probeert een manier te vinden om het oog onschadelijk te maken.

Chan Ho Yin, een Chinese straatartiest met pyrokinetische krachten, wordt ontvoerd door een vrouw genaamd Raina. Zij en haar team willen hem gebruiken om het Extremis-serum verder te perfectioneren. Door de testen nemen zijn krachten fors toe, maar Chan wordt er ook gewelddadiger door. Tijdens een ondervraging later onthult Skye dat ze lid werd van de Rising Tide en S.H.I.E.L.D om haar biologische ouders te vinden. Raina bezoekt Edison Po in in zijn cel en geeft hem opdracht om "the Clairvoyant" in te lichten over hun resultaten.

Er vinden een reeks vreemde sterfgevallen plaats, waarbij mensen door een plotselinge elektrische schok sterven en hun lijken vervolgens blijven zweven. Aanvankelijk wordt gedacht aan een aanslag, maar uiteindelijk blijkt het te gaan om een buitenaards virus. Agent Simmons raakt geïnfecteerd, waarna zij en Fitz een tegengif proberen te vinden. Wanneer de tijd dringt en al haar pogingen lijken te falen, probeert Simmons zelfmoord te plegen. Coulson wordt ondertussen geplaagd door herinneringen aan zijn wederopstanding uit de dood, en gaat op zoek naar antwoorden.

Het team bezoekt een S.H.I.E.L.D.-basis genaamd The Hub en krijgt van agent Victoria Hand opdracht om in Zuid-Ossetia een wapen genaamd "The Overkill" uit te schakelen. Skye en Simmons krijgen echter niks over de missie te horen daar hun lagere rang dit niet toestaat. Ze proberen zelf antwoorden te vinden, waarbij Skye ontdekt dat er geen back-up plan is en Ward en Fitz aan hun lot zullen worden overgelaten als de missie onverwacht mislukt. Ze informeert Coulson hierover.

Tijdens een missie ontdekken ze het bestaan van een Asgaridaans wapen genaamd de Berserker Staff, welke in drie losse stukken op aarde verborgen is en de bezitter bovenmenselijke kracht en razernij geeft. Een Noorse groepering geleid door Jakob Nystrom zit echter ook achter de staf aan. Coulsons team krijgt hulp van een professor genaamd Elliot Randolph. Ward krijgt een stuk van de staf in handen, welke bij hem nare herinneringen aan zijn jeugd losmaakt.

Hannah Hutchins, een vrouw die als veiligheidsinspecteur werkt voor StatiCorp, krijgt de schuld van een reeks mysterieuze gebeurtenissen, zoals explosies en voorwerpen die plots gaan zweven telkens als zij in de buurt is. Wanneer Coulson en zijn team haar meenemen voor onderzoek, dwingt een nieuw incident hen om te landen in onbewoond gebied. Daar wordt de ware oorzaak duidelijk.

Mike Peterson, nu in dienst van S.H.I.E.L.D., wordt door Coulson erbij gehaald wanneer een groep supersoldaten gemaakt door Raina Edison Po helpen ontsnappen uit de gevangenis. Ondertussen houden May en Coulson nog altijd informatie over Skye’s ouders voor haar achter. Raina en Edison ontvoeren Peterson’s zoon Ace en stellen een ruil voor.

Raina weet Coulson over te halen haar zijn geheugen op te laten frissen. Coulson ontdekt zodoende dat hij nooit op Tahiti geweest is voor zijn herstel, zoals hij altijd dacht, en dat zijn wederopstanding een erg nare ervaring voor hem was. Victoria Hand neemt ondertussen de leiding over de zoektocht naar Coulson. Skye wordt uit het team gezet, en gaat eigenhandig op zoek.

Op de S.H.I.E.L.D.-academie onderzoeken Ward, Fitz, Skye en Simmons een reeks aanslagen op studenten, gepleegd met een ijsmachine. Een van de recente slachtoffers is Donnie Gill, maar hij kan tijdig gered worden. Fitz trekt nadien veel met Donnie op, en helpt hem met het maken van een nieuwe krachtbron. Ondertussen bezoeken Coulson en May in Mexico een oud-agent genaamd Richard Lumley, die hen vertelt dat hij 24 jaar geleden betrokken was bij een incident met Skye.

In een poging "The Clairvoyant" te vinden, gaat Coulsons team undercover op een trein waarmee een pakje wordt vervoerd naar Ian Quinn. Ze worden echter ontdekt omdat hun Italiaanse collega Luca Russo hen verraadt, waardoor Coulson en Ward de trein moeten ontvluchten. Fitz en Skye volgen het pakje naar Quinn’s landhuis.

Skye blijkt dodelijk verwond, zonder kans op herstel. Coulson besluit zijn zoektocht naar wat hem uit de dood liet herrijzen te versnellen in de hoop dat dezelfde techniek nu Skye kan helpen. Na wat speurwerk vindt het team een S.H.I.E.L.D.-basis genaamd “Guest House”, alwaar het geneesmiddel te vinden is. Coulson, Ward, Garrett, en Fitz dringen met geweld binnen en activeren zo een zelfvernietigingssysteem. Ondertussen arriveert in Death Valley de Asgardiaanse crimineel Lorelei op aarde.

Lorelei, die de kracht heeft om alle mannen tot haar slaaf te maken, begint een leger en rijkdom op te bouwen in de hoop de aarde te veroveren. Lady Sif komt naar de aarde om Coulson en zijn team bij te staan in de strijd tegen haar. Tijdens een gevecht tussen S.H.I.E.L.D. en een door Lorelei ingelijfde motorbende wordt Ward door Lorelei ingepalmd.

Mike Peterson is nu geheel omgebouwd tot een cyborg genaamd Deathlok. De jacht op "The Clairvoyant" wordt verder uitgebreid. Het team stelt een lijst samen van potentiële verdachten, waaronder Thomas Nash; een catatonische man die beweert psychische krachten te hebben. Het feit dat Deathlok hem probeert te verdedigen versterkt dit vermoeden alleen maar. Skye onderzoekt de zaak, maar komt tot een andere conclusie.

Garretts jet wordt neergeschoten door drones van S.H.I.E.L.D. en hij sluit zich ook bij Coulsons team aan. Het gekaapte vliegtuig vliegt automatisch naar De Hub. Simmons en Triplett doen onderzoek naar Skye’s bloed in de hoop meer te ontdekken over het buitenaardse geneesmiddel, maar hun onderzoek wordt verstoord wanneer S.H.I.E.L.D. wordt aangevallen door HYDRA.

Ward weet Koenigs leugendetector te doorstaan, waardoor niemand zijn banden met HYDRA vermoedt. Coulson, Fitz, Simmons en Triplett gaan op jacht naar Marcus Daniels, een man met superkrachten die het voorzien heeft op celliste Audrey Nathan. Ondertussen verlaat May het team en ontdekt Skye Wards ware aard.

Wanneer Coulson en zijn team terugkeren in de basis, vinden ze de dode Koenig en een bericht van Skye dat Ward voor HYDRA werkt. Skye leidt Ward ondertussen naar een eetcafé en licht de politie in, maar voor ze kan ontsnappen wordt ze gevangen door Deathlok. Ward en Deathlok nemen haar mee in het vliegtuig, maar Coulson kan net voor opstijgen nog aan boord glippen.

Via een reeks flashbacks is te zien hoe Ward als tiener door Garrett uit de gevangenis werd gehaald en tot agent van HYDRA opgeleid. Ze vinden in het hoofdkantoor van Cybertek bewijs dat Garrett al sinds 1990 aan project Deathlok werkt, en dat Garrett zelf de eerste proefpersoon was. Hij is nu echter stervende en heeft het buitenaardse geneesmiddel nodig om te herstellen. Fitz en Simmons, die op eigen houtje achter Ward aan zijn gegaan, worden gevangen. Ian Quinn maakt voorbereidingen om het Deathlok project te presenteren aan de Amerikaanse regering in de hoop een contract bij het leger te krijgen.

Quinns presentatie wordt ruw verstoord door Garrett, die door het geneesmiddel weliswaar is hersteld maar mentaal compleet de weg kwijt lijkt te zijn. Fitz en Simmons worden uit zee gered door Nick Fury. Eenmaal weer compleet begint het team de tegenaanval op Garrett. Ondertussen begint Coulson dezelfde mentale capaciteiten als Garrett te vertonen en vreemde tekens in een muur te kerven.