Bening studierte zunächst in San Francisco Schauspiel und spielte danach jahrelang Theater. Nach einer Tony-Nominierung 1987 und kleineren Rollen in Fernsehproduktionen erhielt sie 1989 in der Adaption des Briefromans Gefährliche Liebschaften von Choderlos de Laclos die Rolle der Catherine Merteuil in dem Film Valmont von Miloš Forman. Der theatererfahrenen Schauspielerin gelang mit diesem Film der Durchbruch in Hollywood.

Bereits für die Rolle in dem ein Jahr später entstandenen Film The Grifters von Stephen Frears war sie für einen Oscar nominiert. Dies widerfuhr ihr erneut im Jahr 2000 für die Rolle der Ehefrau von Kevin Spacey in dem vielfach preisgekrönten Film American Beauty von Sam Mendes, für den sie im selben Jahr auch den London Critics Circle Film Award als beste Schauspielerin bekam.

2005 gewann sie einen Golden Globe als beste Hauptdarstellerin für ihr Porträt einer gelangweilten Londoner Theater-Diva in dem Film Being Julia, für das sie ein drittes Mal für den Oscar nominiert wurde. Für den Part einer erfolgreichen lesbischen Ärztin in The Kids Are All Right (2010) erhielt sie erneut einen Golden Globe sowie den Preis der Filmkritikervereinigung von New York und eine Oscarnominierung als beste Hauptdarstellerin. 2017 ist sie Juryvorsitzende der 74. Internationalen Filmfestspiele von Venedig.

In vielen Filmen wird Annette Bening von Traudel Haas synchronisiert. Sie ist in zweiter Ehe seit 1992 mit Warren Beatty verheiratet, sie haben vier gemeinsame Kinder.