ในปี 1936 ดร.อินเดียน่า โจนส์ (แฮร์ริสัน ฟอร์ด) อาจารย์ผู้เชี่ยวชาญด้านโบราณคดีที่ชอบตามล่าหาขุมทรัพย์ล้ำค่าต่างๆ จากทั่วโลก ครั้งนี้เขาต้องตามหาหีบแห่งบัญญัติศักดิ์สิทธิ์ของโมเสส ที่ว่ากันว่า ผู้ใดได้ครอบครอง ผู้นั้นจะสามารถเอาชนะได้ในทุกสงคราม และขณะนี้ ฮิตเลอร์ได้ส่งคนมาตามหาหีบแห่งบัญญัติศักดิ์สิทธิ์ ดร.โจนส์ต้องรีบค้นมันให้พบก่อนที่พวกนาซีจะเอามันไปได้

ภาคนี้เล่นกับเรื่องความเชื่อและไสยศาสตร์ รวมไปถึงลัทธิบูชายัญการผจญภัย ประเด็นต่าง ๆ ในเรื่องเช่นความเชื่อ หรือการเล่าถึงตำนานต่างๆ เป็นไปอย่างเรียบง่าย เรื่องราวตำนานในภาคนี้เป็นของฮินดู เช่น พระศิวะ เจ้าแม่กาลี ศิวลึงค์ สังฆรา ภาคแรกเรื่องหีบศักดิ์สิทธิ์ที่บรรจุบัญญัติ 10 ประการที่โมเลสนำลงมาจากยอดเขา ส่วนภาค 3 หนังก็เล่นเรื่องจอกศักดิ์สิทธิ์หรือจอกกาลิสที่พระเยซูใช้ในการเสวยพระกระยาหารมื้อสุดท้าย ซึ่งตำนานนี้ยังเกี่ยวโยงมาถึงเรื่องของสงครามครูเสดและอัศวันโต๊ะกลมอีกด้วย นอกจากนี้ก็ยังมีดารารับเชิญ Dan Aykroyd เจ้าหน้าที่สนามบินที่เดินไปคุยไปกับอินดี้

ในปี 1938 อินเดียน่า โจนส์ (แฮร์ริสัน ฟอร์ด) ต้องเดินทางตามหาขุมทรัพย์อีกครั้ง นั่นคือ จอกกาลิซ หรือจอกศักดิ์สิทธิ์ที่พระเยซูใช้ในพระกระยาหารมื้อสุดท้าย แล้วจอกที่ว่านี้ยังเคยรองรับพระโลหิตของพระองค์ตอนถูกตรึงกางเขนมาแล้วด้วย จากนั้นจอกดังกล่าวตกอยู่ในมือของโจเซฟแห่งอารามาเทียอยู่พักหนึ่ง ก่อนจะหายสาบสูญไปนับพันปี เงื่อนงำล่าสุดก็คือ อัศวินสามพี่น้องแห่งสงครามครูเสดเป็นผู้พิทักษ์เอาไว้ คนพี่คนแรกได้เสียชีวิตไปก่อน ส่วนอัศวินคนที่สองก่อนตายก็ได้เปิดเผยความลับนี่แก่หลวงพ่อรูปหนึ่ง ส่วนคนน้องสุดท้องก็ไม่มีใครได้พบ ว่ากันว่าเขายังคงปกป้องจอกนี้อยู่ ในตำนานได้กล่าวไว้ว่า ใครได้ครอบครองและดื่มน้ำจากจอก คนผู้นั้นจะเป็นอมตะ หลังจากที่ ศจ.เฮนรี โจนส์ (ฌอน คอนเนอรี่) พ่อของอินดี้ก็ได้ออกตามหาจอกแล้วก็หายไปก่อนหน้านี้ อินดี้จึงรีบดำเนินการสืบหาร่องรอยของพ่อทันที แล้วการผจญภัยครั้งใหม่ก็เริ่มขึ้นครับ มันนำพาเขาไปพบกับศัตรูดั้งเดิมอย่างพวกนาซีที่ต้องการจอกเช่นกัน

ปี 1957 ในช่วง สงครามเย็น อินเดียน่า โจนส์ (แฮร์ริสัน ฟอร์ด) และสหายของเขา แมค (เรย์ วินสโตน) ได้หลบหนีการตามล่าจากสายลับโซเวียตและได้กลับไปยังมหาวิทยาลัยมาร์แชลบ้านเกิดของโจนส์ เพื่อนของเขาที่เป็นหัวหน้าภาควิชาไม่พอใจกับการกระทำครั้งล่าสุดของเขาและไล่เขาออกจากมหาลัย ในระหว่างที่โจนส์เดินทางไปยังเมืองเขาก็พบกับ มัตต์ วิลเลียมส์ (ไชอา เลอบัฟ) และ มาเรียน ราเวนวูด (คาเรน อัลเลน) ต้องเดินทางข้ามโลกเพื่อออกตามหากะโหลกแก้วศักดิ์สิทธิ์ และต้องต่อสู้กับศัตรูคือเหล่าสายลับรัสเซีย ภายใต้การนำทีมของ อีริน่า สปัลโก้ (เคท แบลนเช็ตต์) ที่ต้องการกะโหลกแก้วมาครอบครองเช่นกันและโจนส์ก็มารู้ทีหลังว่ามัตต์เป็นลูกชายของเขา

เมื่อพบว่าตัวเองอยู่ในยุคใหม่ ใกล้เกษียณ อินดี้ต้องต่อสู้กับการปรับตัวให้เข้ากับโลกที่ดูเหมือนจะโตเกินตัวเขา แต่เมื่อหนวดของความชั่วร้ายที่คุ้นเคยกลับมาในรูปของคู่แข่งเก่า อินดี้ต้องสวมหมวกและหยิบแส้อีกครั้งเพื่อให้แน่ใจว่าวัตถุโบราณที่ทรงพลังจะไม่ตกไปอยู่ในมือคนผิด