Sydney Bristow è una studentessa universitaria che è stata reclutata da una divisione segreta della CIA, denominata SD-6, durante il suo primo anno di college. I sogni della ragazza divengono realtà quando il suo fidanzato le chiede di sposarlo. Sydney gli racconta la verità e Danny viene ucciso dalla SD-6.

Sydney è decisa a distruggere la SD-6, ma a quanto sembra non sarà un lavoro veloce come la ragazza credeva. La SD-6 entra in possesso di un ordigno nucleare, così la giovane chiede aiuto al padre Jack, anch'egli un agente della CIA che sta facendo il doppio gioco. Will si interroga sulla morte di Danny.

Sloane invia Sydney e Dixon a Madrid per recuperare un codice, al quale però è interessata anche un'agente russa, rivale di Sydney. Will continua ad indagare sulla morte di Danny, mentre Francie ha dei problemi con Charlie, il quale potrebbe avere una relazione con un'altra donna. Michael Vaughn è stato sostituito.

Syd e Dixon si occupano di un complotto, il cui scopo è quello di eliminare l'Unione del Commercio Organizzato. Il doppio gioco di Sydney comincia a crearle dei problemi, così Michael prova a confortare la giovane. Syd e Francie scoprono Charlie, mentre sta baciando un'altra donna.

Syd e Dixon aiutano un uomo, che possiede alcune informazioni su un vaccino, ad entrare negli USA. Vaughn presenta a Syd un agente che ha una straordinaria somiglianza con l'uomo da salvare. Will scopre che Danny, prima di morire, stava partendo per Hong Kong, non Singapore, con una misteriosa donna.

Per raccogliere informazioni da un uomo programmato, a sua insaputa, per essere un assassino, Syd va in missione sotto copertura in una specie di manicomio. Charlie dice la verità a Francie e non si tratta di un tradimento. Will è sulle tracce della misteriosa donna di Danny. Ma le cose si complicano.

Sydney aiuta Shepard a fuggire dall'ospedale e viene a sapere che si tratta del killer di Danny. Sloane scopre che il virus nei computer della SD-6 è stato impiantato da qualcuno all'interno della divisione. Jack racconta alla figlia i retroscena che 20 anni prima condussero alla morte di sua madre Laura.

Sloane è deciso a scoprire chi sono le talpe all'interno della SD-6. Jack chiede a Sloane informazioni sulla morte di Eloise Kurtz, colei che ha impersonato la misteriosa donna di Danny. Sydney si occupa di un nuovo mistero legato a Rambaldi e trova ancora sulla sua strada l'agente del KGB Anna Espinosa.

L'uomo di Sloane informa il suo superiore che Sydney è la talpa che la SD-6 sta cercando. Dixon viene colpito durante unaa missione. Syd deve occuparsi di un nuovo mistero che coinvolge Hassan. Sloane ordina alla SD-4 che Syd venga uccisa, ma la CIA intercetta l'ordine. Will fa un passo in avanti nelle indagini.

Sydney è di nuovo sulle tracce di Hassan. Will fa analizzare la cassetta della morte di Eloise e sente le parole "SD-6" ed inizia una nuova indagine su un uomo che si trova in prigione. Jack, che è prigioniero di Hassan, fa una proposta al mercante di armi. Il quale però a sua volta ha appena catturato Sydney.

Vaughn scopre alcuni indizi che potrebbero collegare Jack agli omicidi di alcuni agenti della CIA, avvenuti alcuni anni prima. Syd e Dixon devono occuparsi del socio di Hassan, che ha preso il posto del mercante d'armi nel piano criminale. Jack rivela a Sydney che sua madre era un agente del KGB.

Alcuni uomini armati, comandati da Cole, penetrano nella SD-6. Cole è deciso a vendicarsi di Sloane, il suo ex-boss. Will inizia a temere per la propria vita, ma una donna lo sprona a proseguire con la sua indagine. Vaughn, dopo la scoperta sulla madre di Syd e sulla morte di suo padre, va in terapia.

Vaughn disobbedisce agli ordini e tenta di aiutare Jack e Sydney ad impedire la distruzione della SD-6. Cole continua la ricerca di un misterioso dispositivo. Will indaga sulla morte della moglie di McNeil, che è stata fatta passare per un suicidio. Cole viene catturato dalla CIA, insieme ad una misteriosa fiala con liquido.

Sydney e Dixon si recano a Las Vegas per indagare su un agente che potrebbe avere avuto dei legami con il gruppo di Cole. McNeil esorta Will ad indagare su di un software che potrebbe fornire una importante lista di utenti. Syd scopre che Charlie, mentre stava con Francie, è uscito con un'altra.

Vaughn chiede a Sydney di usare la sua amicizia con la moglie di Sloane per avere accesso ad un antico libro di Rambaldi. Will viene rapito da qualcuno che gli chiede di mettere fine alle sue indagini. Vaughn, grazie al liquido contenuto nella fiala di Cole, visualizza, in una pagina bianca del libro, l'immagine di Sydney.

Il capo della SD-9, Edward Poole, arriva negli USA con alcune informazioni circa un traditore all'interno dell'alleanza dei 12. Per tradurre il testo della Profezia contenuto nel libro antico di Rambaldi, deve essere usato un codice conservato in Vaticano.

Sydney viene fermata da alcuni agenti federali ed interrogata circa i suoi rapporti con la CIA, la SD-6 ed il manoscritto di Rambaldi. Intanto Vaughn e Jack tentano il tutto per tutto per liberare Sydney e per provare che la giovane non è collegata alla profezia enunciata da Rambaldi.

Mentre è impegnata in una nuova missione a Vienna, Sydney si imbatte in una sua vecchia fiamma, nonché altro agente, Noah Hicks, che l'ha piantata cinque anni prima. Jack consulta uno psichiatra, dopo aver scoperto che sua moglie Laura è ancora viva. Will e Francie cominciano a nutrire alcuni sospetti su Syd.

L'antica passione sembra riaffiorare tra Sydney e Noah. La ragazza nel frattempo continua a fare nuove scoperte sulla madre e sul piano originario del KGB che coinvolse lei e suo padre. Il Direttorio K manda un killer per uccidere Khasinau. Si tratta di una persona molto vicina a Sydney e la SD-6.

Nel tentativo di intrappolare Khasinau, Sydney e Michael preparano la vendita di un manufatto di Rambaldi. Ma gli agenti della SD-6 sono sulle loro tracce. Will scopre l'identità di uno dei suoi assalitori: si tratta del padre di Syd. La moglie di Sloane, in punto di morte, rivela a Syd di aver sempre saputo della SD-6.

Jack vuole scoprire la talpa che ha passato informazioni a Will e così istruisce il giornalista. Sloane minaccia di dimettersi dopo che l'Alleanza ha deciso di uccidere sua moglie e così finisce per concludere un patto con Sark. A Parigi le strade di Will e Syd si incrociano. Il giornalista viene messo sotto custodia protettiva.