a sua carriera di attrice è cominciata nel 1992 con il film Senza via d'uscita. Il suo ruolo di Marcia Brady in Growing Up Brady (2000) ha attirato l'attenzione della critica, così come la successiva parte nella sitcom Ladies Man. Nel 2004, oltre al ruolo di protagonista in 8 semplici regole, ha partecipato alla miniserie Magnitudo 10.5, al film TV Crimini con stile nonché alla pellicola indipendente Debating Robert Lee. Nel 2005 ha fatto parte del cast della serie TV Streghe impersonando Billie Jenkins. Dal 2007 è tra gli interpreti della sitcom The Big Bang Theory.

Nel 2004, Kaley è stata nominata la settantaquattresima donna più sexy degli Stati Uniti al FHM-US's 100 Sexiest Women. Nello stesso anno, nella versione americana del cartone animato di Disney Channel Brandy and Mr. Whiskers, Kaley ha doppiato il personaggio Brandy Harrington. Sempre nel 2004, è stata co-protagonista con Nick Carter e Kevin Zegers nel film The Hollow. Kaley ha anche doppiato una delle due "gemelle in rosa" nel gioco per PlayStation Bratz. Nel settembre 2010 è era rimasta vittima di un incidente a cavallo che le ha procurato una frattura della gamba destra. Inizialmente i medici, pensando a un'infezione, avevano previsto l'amputazione del piede destro, ipotesi successivamente sventata.Il 31 dicembre 2013 Kaley ha sposato il tennista Ryan Sweeting, conosciuto nell'agosto dello stesso anno, da cui ha poi divorziato nel settembre 2015; durante il matrimonio ha aggiunto il cognome del marito al suo, facendosi accreditare in quegli anni come Kaley Cuoco-Sweeting.

Ha condotto la cerimonia di premiazione dei Teen Choice Awards 2011, e quelle dei People's Choice Awards 2012 e 2013. Sempre nel 2013 la rivista Forbes la inserisce al secondo posto tra le attrici più pagate della TV, con un guadagno di undici milioni di dollari; dal 2014, dopo il rinnovo del suo contratto con la sitcom The Big Bang Theory, percepisce un assegno di oltre un milione di dollari a episodio, diventando (assieme ai colleghi di set Johnny Galecki e Jim Parsons) tra gli attori di serie televisive più pagati di sempre. Nello stesso anno, nel mese di novembre riceve una stella sulla Hollywood Walk of Fame.