Sylvie Testud naît le 17 janvier 1971 à Lyon. Ses parents se séparent lorsqu'elle a deux ans. Elle passe sa jeunesse dans le quartier lyonnais de la Croix-Rousse, élevée par sa mère, comptable. Au lycée, elle apprend le chinois. Très tôt fascinée par le cinéma, la jeune fille s'identifie notamment au personnage d'ado complexée incarné par Charlotte Gainsbourg dans L'Effrontée. Montée à Paris pour suivre des études d'histoire, elle se lance bientôt dans la comédie en intégrant la classe libre du Cours Florent puis le Conservatoire, où elle a pour professeurs Jacques Lassalle et Catherine Hiegel. Elle fait sa première apparition à l'écran en 1994 dans Couples et amants.

Elle décide de devenir actrice au cours de sa jeunesse, après avoir admiré les actrices dans les films. Elle prend alors des cours de théâtre à Lyon avec le comédien et metteur en scène Christian Taponard. En 1989, elle s'installe à Paris pour suivre des études d'histoire, ainsi que des cours d'art dramatique aux classes libres du Cours Florent, puis au Conservatoire national supérieur d'art dramatique pendant trois ans, avec Jacques Lassalle et Catherine Hiegel pour professeurs.

Au début des années 1990, elle obtient ses premiers petits rôles au cinéma, puis dans des longs métrages comme L'Histoire du garçon qui voulait qu'on l'embrasse de Philippe Harel (1994), Le Plus Bel Âge..., de Didier Haudepin (1995) ou encore Love, etc. de Marion Vernoux (1996).

En 1997, Sylvie Testud connaît un premier grand succès au cinéma en Allemagne avec le film Au-delà du silence de Caroline Link, pour lequel elle apprend l'allemand, la clarinette et la langue des signes. Elle est récompensée en tant que meilleure actrice par le Prix du film allemand (l'équivalent du César de la meilleure actrice). En 1998, elle joue son premier grand rôle au cinéma français et connaît un grand succès en France avec le rôle de Béa dans Karnaval, le premier long-métrage de Thomas Vincent, pour lequel elle est nommée au César du meilleur espoir féminin et reçoit le Prix Michel Simon. Elle commence alors une importante carrière d'actrice avec une préférence pour le cinéma d'auteur.

En 2000, sa prestation dans La Captive de Chantal Akerman (adaptation du roman La Prisonnière de Marcel Proust) lui vaut une nomination en tant que meilleure actrice au Prix du cinéma européen. En 2001, elle obtient, pour sa deuxième nomination, le César du meilleur espoir féminin pour l'interprétation remarquée de Christine Papin, une des sœurs Papin, dans Les Blessures assassines de Jean-Pierre Denis, d'après un fait divers de 1933.