小さな田舎町で巻きおこる謎の妖怪騒動！ある日、小学生の桜ふみえは、ムダ毛妖怪「モッサモッサ」に襲われる！！そこに偶然現れた、母親を探して旅をする妖怪園児「お・お・お・のしんのすけ」とその父、妖怪「タマタマ親父」！この二人との出会いが壮大な妖怪事件簿の始まりだった・・・

妖怪親子を家に連れて帰るふみえ。突然強い妖気を感知したしんのすけはふみえと共に発信源へ向かう！しかしそこには母親ではなく、いらない物を容赦無く捨てる「妖怪ポイポイババア」が家族を襲っていた！困った家族に助けを求められたふみえとしんのすけは仕方なく妖怪を退治することに‥

ふみえはしんのすけを使って妖怪を退治する「ヨーカイバスターズ」を結成！それを学校でアピールしようとするが、クラスメートは給食のカレーに夢中。そんな楽しい給食時間に食べ物を超激辛にしてしまう「妖怪スパイス娘」が現れ学校は大混乱！さぁ、いまこそ「ヨーカイバスターズ」の出番だ！！

静かな山奥の温泉宿に妖怪が現れたと連絡を受けた「ヨーカイバスターズ」は早速現場に急行する！ が、温泉にいたのはバカ騒ぎをしているただのパーティーピーポーでがっかり。しかしその時、温泉の湯の中から「妖怪ユノハナー」が現れ、その花粉を吸い込んだしんのすけたちもパリピにされてしまう・・・

最近キャンプ場で人々が行方不明になっているという噂を聞きつけたふみえたちは早速現場へ。うす暗い森の奥から聞こえてくる歌を辿って行くと「妖怪マツタケ大王」によって、キノコに変身させられた人々を発見する！突如現れた「マツタケ大王」に隙を突かれ、ふみえはキノコに、しんのすけはトリュフにされてしまう！？

ふみえの家でくつろぐしんのすけ、そこに突如聞こえてくるしんのすけを呼ぶ母親みさえの声、今度こそかーちゃんだと一人で家を飛び出し、廃墟の病院にたどり着く。みさえの声はさらに大きくなり、その病院の中にしんのすけを誘う。だがそこには妖怪使いの怪しい罠が張り巡らされていた！？

妖怪使い・ディーノは「妖怪不景鬼」を呼び出し、しんのすけを助けに来たふみえたち共々、無気力にさせようとする。なんとか振り切って逃げようとするバスターズだが、数で勝る「妖怪不景気」に追い詰められ絶体絶命！ そして行方不明の母親みさえの居場所とは・・・！？

ついに念願の母と妹に再会し、妖怪野原家は一家団欒。家族が揃った事で妖怪事件に興味がなくなり家に帰りたいしんのすけ、妖怪使いディーノの暴走を止めたいふみえ、二人は対立しケンカしてしまう。このまま「ヨーカイバスターズ」は解散してしまうのか！？

突如、町中に妖怪が溢れかえり町の人々は大混乱！体育館に避難した怯える町民たちに、町長は非常事態宣言を発令し町から避難を促す！しかしふみえは、町長だけが妖怪に襲われないことに違和感を感じ、１人町長の後を追うふみえだが、そこには驚愕の事実が待ち受けていた！？

なんとこの町で起きていた妖怪事件の黒幕は町長だった！妖怪使いを使って町の人々を追い出し、巨大カジノを建設しようとしていたのだ！そしてその計画の最後の仕上げとして、壺に封じられた最凶の妖怪・「妖怪大統領」を復活させようとする。果たして、しんのすけたちは町長の野望を阻止できるのか！？

壺から出現した物体は町長の体をのっとり、最凶妖怪の力を使いバスターズを追い詰める。戦いの最中、町長の口からを吐き出された悪気の塊を浴びたみさえとひろしは自我を失った凶暴妖怪となってしまう。そして、ついにしんのすけも悪気の塊を浴びてしまい・・・

ふみえの逆ギレパワーで正気に戻ったしんのすけ達。だが町長の体から解き放たれた「妖怪大統領」はついにその巨大な真の姿を現す！！町へ向かう妖怪大統領に妖怪バスターズが最後の力を振り絞って立ち向かう！最凶妖怪・妖怪大統領と妖怪バスターズの最終対決が今始まる！