Spider-Man (Peter Parker), Iron Spider (Amadeus Cho) e l'agente Venom (Flash Thompson) sconfiggono il Dottor Octopus e lo conducono sul Trivelivolo dello S.H.I.E.L.D. per essere imprigionato. Qui Octopus utilizza uno dei suoi Octo-Bot in miniatura per incidere i naniti di Swarm (anch'egli prigioniero) infettando tutti i sistemi del Trivelivolo e trasformandolo nella nuova isola volante dell'H.Y.D.R.A.! Tutto ciò fa parte del piano di Arnim Zola per conquistare il mondo e vendicarsi di Nick Fury. Il Dottor Octopus ha infatti stretto un accordo con l'H.Y.D.R.A., potenziando tutti i suoi soldati con una nuova formula avanzata del siero di Goblin

Dopo essere stato salvato dal misterioso Scarlet Spider, il quale afferma di essere il "primo" Spider-Man (frutto degli esperimenti operati su di lui dal Dottor Octopus di cui intende vendicarsi), Spider-Man deve radunare anche Iron Spider e l'agente Venom per cercare di fermare i piani di conquista di Arnim Zola, Dock Ock e dell'H.Y.D.R.A.

Non essendo riuscito a convincere Norman Osborn a trasformarsi di nuovo in Green Goblin, il Dottor Octopus arruola il malvagio Barone Mordo per usare il Seggio Periglioso e portare il Goblin dell'universo Ultimate nel suo mondo. Con l'aiuto del Dottor Strange, Spider-Man deve arruolare Miles Morales (lo Spider-Man dell'Universo Ultimate) per sconfiggere Goblin. Durante la battaglia, Miles è costretto a distruggere il Seggio Periglioso e senza di esso non può far ritorno nella sua dimensione.

Miles Morales è costretto a rimanere nella realtà di Spider-Man fino a che gli scienziati dello S.H.I.E.L.D. non riusciranno a trovare un modo per farlo tornare nel suo universo. Soprannominato Kid Aracnid, Miles entra a far parte della nuova squadra di Spider-Man, i Web Warriors, ed aiuta Peter a salvare le vite di Norman Osborn e di suo figlio Harry minacciati dal Dottor Octopus e dall'Avvoltoio, a cui Octopus ha fornito una nuova armatura potenziata. Però Harry e Norman non sono del tutto indifesi grazie alle loro armature da Iron Patriot. Quando Ock infetta l'armatura di Avvoltoio, Spider-Man e Kid Aracnid scoprono grazie al volatile che c'è una spia di Dock Ock nello S.H.I.E.L.D.. Cosí i due imprigionano Ock, ma l'Avvoltoio scappa.

I compagni di classe di Spider-Man all'Accademia S.H.I.E.L.D. iniziano il nuovo programma di allenamento installato da Leo Fitz e Jemma Simmons. Qui, l'arrampicamuri e il resto dei guerrieri ragno, si mettono alla ricerca della spia di Dock Ock menzionata dall'Avvoltoio. All'improvviso durante il test, i marchingegni di addestramento perdono il controllo. I guerrieri ragno, tranne Spidey, pensano subito che il doctor Connors sia la spia. Cosí questi si recano da lui ma lo trovano ritrasformato in Lizard. Il lucertolone possiede un morso contagioso che infetta e trasforma tutti i guerrieri ragno e gli agenti dello Shield. Fortunatamente, Spidey trova un antidoto. Però, si scopre che in realtà era Rhino la spia e non solo libera Dock Ock ma cattura anche Venom.

Dopo che il Dottor Octopus e Rhino sono fuggiti dal Triskelion con l'Agente Venom nelle loro grinfie, Spider-Man e Scarlet Spider li inseguono fin nello spazio sulla base dell'H.Y.D.R.A. dove Octopus ed Arnim Zola lavorano per separare il simbionte da Flash Thompson. Spider-Man e Scarlet Spider devono combattere contro Kraven il Cacciatore, con la tuta del simbionte addosso, che cerca di ottenere un posto in squadra nei Nuovi Sinistri Sei.

Mentre Spider-Man ed Iron Spider continuano la caccia ad Avvoltoio, la loro ricerca li porta su un'isola, dove scoprono che il Dottor Octopus ha catturato l'Uomo Sabbia ed ha clonato dai suoi campioni numerosi cloni di sabbia al fine di trovare la formula del perfetto "Ultimate Sandman"! Riusciranno Peter e Amadeus Cho a mettere da parte i loro diversi punti di vista sugli avversari e ad impedire che l'Uomo Sabbia venga selezionato nei nuovi Sinistri Sei?

Spider-Man e l'Agente Venom stanno sconfiggendo tutti i supercriminali che potrebbero essere possibili reclute dei nuovi Sinistri Sei, come Shocker, Grizzly, Shriek e Beetle. Quando il Dottor Octopus (in coppia con il Dr. Micheal Morbius) crea in laboratorio un nuovo simbionte che si nutre di quello originale, l'Anti-Venom prende il controllo di Harry Osborn. Peter e Flash devono collaborare con Iron Patriot per liberare Harry dall'Anti-Venom prima che prosciughi completamente l'energia del simbionte originale.

Rispondendo ad un segnale di soccorso di Nick Fury che li porta in un centro commerciale abbandonato nel Queens, Spider-Man, Kid Aracnid, Iron Spider e Scarlet Spider trovano una camera sotterranea dove rilasciano inconsapevolmente il pericoloso supercriminale noto come Hydro-Man. Quando Hydro-Man costringe lo Spider-Jet a compiere un atterraggio d'emergenza nel quartiere dove abita zia May, i Web Warriors devono trovare un modo per sconfiggerlo, mentre Scarlet Spider mette al sicuro zia May.

Dopo aver sconfitto Shriek, Spider-Man si unisce Flash Thompson, Amadeus Cho, Miles Morales e Ben Reilly per la festa di compleanno di zia May. Intanto il Dottor Octopus ha completato la formazione dei suoi nuovi Sinistri Sei con Kraven, Ultimate Goblin, Hydro-Man, Electro e Rhino. Durante un primo attacco al Triskelion i Sinistri Sei vengono sconfitti dagli studenti dell'Accademia dello S.H.I.E.L.D., ma Spider-Man è colto di sorpresa quando scopre che c'è un settimo membro nel gruppo di Octopus che da tempo è infiltrato tra di loro: si tratta di Ben Reilly, Scarlet Spider che gli rivela che era un ragazzo che viveva per strada finchè Otto non lo ha trovato salvandolo dalla strada e gli ha dato i poteri che possiede e che quindi essendo Octopus il suo benefattore gli deve la sua lealtà per averlo aiutato quando non aveva avuto nessuno che gli desse una mano.

Scarlet Spider permette al Dottor Octopus di scoprire che Spider-Man è in realtà Peter Parker. Octavius si prepara così alla prossima mossa del suo piano che prevede di ottenere la chiave per attivare il cannone Anti-H.Y.D.R.A. Peter ha lasciato la chiave a casa di zia May e corre a proteggere sua zia. Scarlet Spider, che negli ultimi tempi è riuscito a conquistarsi la fiducia della donna prende la chiave e fa per andarsene con una scusa, ma in casa trova Flash Thompson che avendo capito che Scarlet lavora per Octupus tenta di fermarlo. Purtroppo questi è ancora convalescente e senza il simbionte non riesce a fermarlo; Octopus riesce così ad attivare l'arma e la usa per trasformare l'Isola dell'H.Y.D.R.A. nella sua Isola di Octopus e sbarazzarsi di Arnim Zola. Quando tutto il Queens viene distrutto e zia May si trova in serio pericolo, all'ultimo momento Ben decide di aiutare Peter e sacrifica la vita facendola sprofondare con l'Isola di Octopus.

Nova fa ritorno al Triskelion portando con sé tre misteriosi oggetti in un cofanetto di cui la scritta su di esso è in lingua Inumana. Arruolato il giovane Inumano dell'Accademia S.H.I.E.L.D. Triton, Spider-Man si dirige verso la città abbandonata di Atarog, in Tibet, dove crede di poter ritrovare lo scomparso Nick Fury. Durante questa missione, Spider-Man e Triton incontrano Madame Web, una donna in grado di prevedere molti futuri possibili, e i tre s'imbattono in un gruppo di agenti H.Y.D.R.A guidati dal mercenario Crossbones. Questi intende usare il suo prigioniero Nick Fury come merce di scambio per ottenere Madame Web.

Spider-Man and Agent Venom discovered Hydra and Morbius' plan to create a new and improved Venom Bomb.

Spider-Man, Captain America and S.H.I.E.L.D Academy must band together to save New York.

Spider-Man e gli altri eroi devono sconfiggere il Dr. Morbius (trasformato in vampiro dal dottor Octopus) per impedirgli di usare Carnage Queen (Mary Jane contaminata dal simbionte) come arma.

Spider-Man and Kid Arachnid travel to alternate dimensions to gather the shards from the broken Siege Perilous.

Spider-Man and Miles, tracking the missing pieces of the Siege Perilous, travel to a tropical Pirate dimension where they meet Web Beard, the Spider-Pirate, and encourage him and his old team to work together to save themselves from the dreaded Kraken.

Spider-Man and Kid Arachnid arrive in the Noir Universe where they have to prevent Mr. Negative from using the Siege Perilous to drain all the life and color out of the world.

Spider-Man, having collected all of the shards of the Siege Perilous, returns to Miles Morales' universe and confronts Wolf Spider.

Trick-or-treaters start turning into monsters and Spider-Man, Dr. Strange and Ant-Man must team up to stop Baron Mordo.

Spider-Man must team with the former traitor, Scarlet Spider, to stop Doc Ock from reawakening a secret program designed to create evil duplicates of Spider-Man.

Spider-Man and Scarlet Spider have to infiltrate the sunken Hydra Island so Scarlet can destroy the lab that created him.

Spider-Man puts the Triskelion on lockdown when a mysterious villain begins to take out the heroes one at a time.

Spider-Man house sits on Christmas Eve and is forced to team up with Moon Knight to defend the home from the new Mysterio.

Spidey must track down Ock before he harms Aunt May.

Peter Parker must find a way to stop Doctor Octopus and the Superior Sinister Six from destroying all of the heroes in New York and taking over the world.