Sydney Bristow è una studentessa universitaria che è stata reclutata da una divisione segreta della CIA, denominata SD-6, durante il suo primo anno di college. I sogni della ragazza divengono realtà quando il suo fidanzato le chiede di sposarlo. Sydney gli racconta la verità e Danny viene ucciso dalla SD-6.

Sydney è decisa a distruggere la SD-6, ma a quanto sembra non sarà un lavoro veloce come la ragazza credeva. La SD-6 entra in possesso di un ordigno nucleare, così la giovane chiede aiuto al padre Jack, anch'egli un agente della CIA che sta facendo il doppio gioco. Will si interroga sulla morte di Danny.

Sydney è di nuovo sulle tracce di Hassan. Will fa analizzare la cassetta della morte di Eloise e sente le parole "SD-6" ed inizia una nuova indagine su un uomo che si trova in prigione. Jack, che è prigioniero di Hassan, fa una proposta al mercante di armi. Il quale però a sua volta ha appena catturato Sydney.

Vaughn scopre alcuni indizi che potrebbero collegare Jack agli omicidi di alcuni agenti della CIA, avvenuti alcuni anni prima. Syd e Dixon devono occuparsi del socio di Hassan, che ha preso il posto del mercante d'armi nel piano criminale. Jack rivela a Sydney che sua madre era un agente del KGB.

Vaughn chiede a Sydney di usare la sua amicizia con la moglie di Sloane per avere accesso ad un antico libro di Rambaldi. Will viene rapito da qualcuno che gli chiede di mettere fine alle sue indagini. Vaughn, grazie al liquido contenuto nella fiala di Cole, visualizza, in una pagina bianca del libro, l'immagine di Sydney.

Sydney viene fermata da alcuni agenti federali ed interrogata circa i suoi rapporti con la CIA, la SD-6 ed il manoscritto di Rambaldi. Intanto Vaughn e Jack tentano il tutto per tutto per liberare Sydney e per provare che la giovane non è collegata alla profezia enunciata da Rambaldi.

Per salvare la vita di Will, Sydney e Vaughn devono distruggere l'ennesimo dispositivo. L'Alleanza decide alla fine il destino di Emily Sloane. Jack scopre chi è la talpa che lavora per Khasinau all'interno della CIA. Quest'ultimo ha rapito Syd. La giovane incontra "l'Uomo", ma si tratta di una donna: sua madre.

Laura spara contro la figlia. Dixon rivela a Sloane di essere certo del fatto che Syd sta facendo il doppiogioco. Quest'ultima deve scoprire se Vaughn è ancora vivo. Dopo la morte della moglie, Sloane entra a far parte dell'alleanza. Will ritratta quanto scritto sulla SD-6. Laura / Irina si arrende alla CIA.

Sloane è scomparso ed il suo posto viene preso da Geiger. Questi nutre dei sospetti nei confronti di Sydney e suo padre. Will lascia il ristorante di Francie e i due si scambiano un bacio romantico. Geiger legge una e-mail di Sloane che rivela chi sono gli agenti doppiogiochisti.

Will indaga su Doren e scopre che si tratta di Francie. Sloane cattura Jack e lo informa che la macchina di Rambaldi è quasi pronta. Syd neutralizza la falsa Francie, subito dopo si risveglia in una strada di Hong Kong, dove Vaughn le annuncia che era stata data per morta, dispersa in azione da ormai due anni.

Dopo aver ricevuto alcune spiegazioni da Vaughn, Syd decide di fuggire, ma viene fermata e portata in ospedale, dove scopre che suo padre è in prigione. Per ottenere la sua scarcerazione, Syd partecipa ad una missione per recuperare un chip. Jack mostra alla figlia un filmato dove lei sta uccidendo un diplomatico russo.

Sydney, Vaughn, Jack e Dixon vengono reclutati da una sezione occulta della CIA che ha come capo nientemeno che Sloane. La prima missione è quella di recuperare un isotopo prima che questo finisca nella mani sbagliate. Nel frattempo, la riconciliazione fra Sydney e Vaughn è messa in dubbio, sebbene Lauren sia morta. Sydney ha scoperto un segreto del padre Jack che potrebbe minacciare la loro relazione.

Nonostante l'opposizione di Sydney, Sloane manda la ragazza e suo padre in missione per fermare una sorta di moderno samurai. Nadia è riluttante sul fatto di accettare o meno di tornare nei servizi segreti. Syd rivela a Vaughn di aver scoperto che Jack ha fatto uccidere Irina.

La battaglia finale si svolge in Mongolia, dove Sloane ha rinvenuto la tomba di Rambaldi, si prepara ad utilizzare l'Orizzonte e a scatenare una strage mediante un doppio attacco missilistico. La lotta per fermare lui e la sua complice Irina richiede il sacrificio estremo di Jack. Sette anni dopo, Sydney e Vaughn sono felici su una casa sulla spiaggia insieme ai loro due bambini.