Neta de italianos, Eloísa Mafalda já nasceu alegre. Diz brincando: “Eu era infeliz e não sabia”. Na verdade, as dificuldades financeiras da família, lhe eram passadas de forma alegre, pois tudo o que queria era se divertir. Em 1940, os pais se separaram e o irmão Oliveira Neto foi ser locutor nas Rádios Tupi e Difusora de São Paulo. Mafalda foi ser costureira. Depois foi trabalhar como auxiliar de escritório nas Emissoras Associadas, onde conheceu a alemã Alice Waldvoguel, que lhe ensinou sobre arte e interpretação.Antes, aos 12 anos, quase participou dos Jogos Olímpicos de 1936, porque era ótima nadadora, mas sua ida à Olimpíada acabou não dando certo pois o pai dela não deixou.Ela mesma conta esta história em seu depoimento ao museudatv.

O início da vida artística de Eloísa Mafalda aconteceu por acaso. O irmão Oliveira Neto foi para a Tupi-Tamoio, do Rio de Janeiro. Para trazer a irmã, a convenceu a fazer um teste de rádio-teatro. Mafalda fez e foi aprovada, passando a trabalhar em radionovelas da Rádio Nacional e em seguida, foi para a televisão atuar na TV Paulista.

Eloísa Mafalda permaneceu na TV Paulista até o seu término, quando esta foi vendida para a TV Globo, onde a atriz interpretou papéis inesquecíveis na sua carreira como a Dona Nenê da primeira versão de A Grande Família; a Maria Machadão de Gabriela; Dona Mariana em Paraíso; Gioconda Pontes em Pedra sobre Pedra e Manuela em Mulheres de Areia. Porém, sem dúvida, o seu maior sucesso foi Dona Pombinha Abelha em Roque Santeiro. Conhecida no Brasil todo e no estrangeiro, a antiga secretária, a discípula de Dona Alice, muito se espanta e se comove com seu sucesso. E diz de forma graciosa, simpática, verdadeira: “Tudo aconteceu por acaso. Eu não queria ser atriz. Foi tudo uma brincadeira”.

Estreou no cinema em 1950 no filme Somos Dois. No teatro, estreou em 1965, na peça O Morro dos Ventos Uivantes. Pouco se dedicou à estas áreas de atuação artística.

Eloísa Mafalda foi casada com Miguel Teixeira e tem dois filhos. Além dos problemas de memória, convive com as sequelas de uma fratura no fêmur, após um tombo em casa.

Em 2012, cedeu entrevista ao Vídeo Show onde relembrou personagens de sucesso que interpretou na Rede Globo e ao blog do autor Aguinaldo Silva.